4066金沙总站app

精品资源共享 安徽省共享课程 合肥工业大学研究生精品课程
4066金沙总站app
电子教案

高级微生物

讲义

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

食品与生物工程学院

 

 

 


目录

 

第一章 绪论 ....................................1

第二章 微生物的多样性及其基因资源 ..............18

第三章 重要的工业微生物 ........................27

第四章 微生物遗传 ..............................29

第五章 微生物药物产生菌的菌种选育 ..............49

第六章 DNA重组及基因工程构建 ...................59

第七章 微生物发酵与发酵工程 ....................60

第八章 微生物在生物技术中的重要作用 ............74

第九章 微生物活性物质的结构与功能 ..............84

第十章 微生物学研究进展及其应用 ................86

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


第一章  绪论

一、 微生物与人类关系

微生物给人类能带来利益吗?

微生物给人类也带来危害吗?

微生物给人类带来的利益不仅是享受,而且涉及到人类的生存。

微生物是人类的朋友

1.1 对生命科学的贡献

生命科学由整体或细胞研究水平进入分子水平,取决于许多重大理论问题的突破,其中微生物起了重要甚至关键的作用,特别是对分子遗传学和分子生物学的影响最大。

长期争论而不能得到解决的“遗传物质的基础是什么?”的重大理论问题,是在以微生物为材料进行研究所获得的结果才无可辩驳地证实:核酸是遗传信息的携带者,是遗传物质的基础, 从而促进了许多重大理论问题的突破。

60年代Nirenberg等人通过研究大肠杆菌无细胞蛋白质合成体系及多聚尿苷酶,发现了苯丙氨酸的遗传密码,继而完成了全部密码的破译,为人类从分子水平上研究生命现象开辟了新的途径。

70年代,由于在微生物中的许多重大发现,包括质粒载体,限制性内切酶,连接酶,反转录酶等,才导致了DNA重组技术和遗传工程的出现,使整个生命科学翻开了新的一页。

1.2 微生物被广泛应用在工业、农业、医药等领域。

例如:面包、奶酪、啤酒、抗生素、疫苗、维生素、酶等重要产品的生产,微生物在其中起到了其他生物不可替代的作用;同时微生物也是人类生存环境中必不可少的成员,有了它们才使得地球上的物质进行循环,否则地球上的所有生命将无法繁衍下去。

据保守估计,自从抗生素被广泛应用于传染病治疗以来,全球的人均寿命至少延长了15岁!

二、 微生物是人类的敌人

微生物是一把十分锋利的双刃剑,这把双刃剑的另一面--微生物的“残忍”性给人类带来的灾难有时甚至是毁灭性的。

举例:

天花:公元165年,一场可怕的流行性天花席卷了整个罗马帝国。仅在罗马每天都有2000人死亡,它整整肆虐了15年。 

鼠疫:即黑死病,在公元3~6世纪,它席卷了整个罗马帝国。

公元1346~1361年,爆发了一场著名的黑死病潮,在这场病中,总共有2400万人死亡,相当于整个欧洲大陆人口的1/3

一些历史学家认为这场灾难甚至改变了欧洲文化。

流行性感冒: 400多年前,意大利威尼斯城的一次流感大流行使六万人死亡,惊慌的人们认为这是上帝的惩罚,所以将这种病命名“魔鬼”

1957年和1968年发生的两次全球性流感,病人总数达10亿多 

流感病毒,属粘病毒科基因组为负链单链RNA基因组分成8个片段,分别编码不同的蛋白

斑疹伤寒: 18126月,这种由虱子传染的疾病曾经毁掉了拿破仑的大部分军队。

拿破仑率领近50万大军入侵俄国,当大军行至波兰和俄国西部的时候,近半数士兵因斑疹伤寒和痢疾而死亡或丧失行动能力。至18136月撤出莫斯科行动结束时,拿破仑手下只有3000多名士兵。 

1985年发现首例艾滋病病人,截止2001年底,全国累计报告艾滋病病毒感染者30736人,其中艾滋病病人1594例,死亡684例。专家估计,实际艾滋病病毒感染者已超过85万人,现存活艾滋病病人约8~10万。

主要分布:

云南(10 525例)新疆(6 030例)广西(3 740例)

广东(2 704例)  河南(1 677例)四川(1 139例)

北京(911例)  安徽(538例)   上海(529例)

微生物引起肿瘤: 约有16%的肿瘤是由病毒感染引起的

已经确认的引起肿瘤的病毒有:

Epstein Barr 病毒:引起鼻咽癌,伯杰氏淋巴瘤等

乙肝病毒:肝癌

丙肝病毒:肝癌

人乳头瘤病毒(1618型):子宫颈癌

T细胞白血病病毒:白血病

 

微生物疾病的现实威胁:

原来的病原微生物并没有消失

鼠疫:在我国许多地区依然时有发生

结核病:在得到有效控制后,近年再度猖獗

病毒性肝炎:仍然是我国危害最广的疾病之一

疟疾:热带地区的多发病……

新的病原微生物不断产生……

全球死亡率最高的疾病

. 几位微生物学家

微生物学奠基人——巴斯德

路易·巴斯德(18221895)法国化学家、微生物学家,近代微生物学的奠基人。出生在法国东部的多尔。 

1862年,当选为法国科学院院士。

1867—1888年间,任巴黎高等师范学校物理化学实验室主任,提出发酵理论,研制成功羊炭疽病、鸡霍乱、猪霍乱、狂犬病疫苗。

现代细菌学之父——科赫

罗伯特·科赫(1843—1910),德国生物学家。大学毕业后,踏上乡村医生的道路。在自己的诊所里,科赫发明了细菌分离法、细菌染色法。

此后,科赫又发现了霍乱弧菌、疟原虫、锥体虫等病原菌,发现了治疗牛瘟、淋巴腺鼠疫、回归热、昏睡病等传染病的方法。1905年,被授予诺贝尔生理学及医学奖。

汤飞凡,中国第一代医学病毒学家

1897723日生于湖南醴陵县。1958930日卒于北京。1914年考入湘雅医学院,1921年毕业并获得美国康涅狄克大学医学博士学位。

1955年首次分离出沙眼衣原体,无可争辩地结束了半个多世纪关于沙眼病原的争论。 

田波院士

田波,男,19311225日生于山东桓台县, 分子病毒学与生物工程研究室主任,中国科学院微生物所研究员、中科院院士、著名病毒学与生物工程专家 

魏江春院士

男,汉族,陕西省咸阳市秦都区人,1931111日生,中共党员。俄罗斯生物科学博士、中国科学院微生物研究所研究员、中国科学院院士。地衣真菌学家,主要从事地衣生物多样性及其系统演化生物学研究,尤其对世界范围石耳科 (Umbilicariaceae)地衣进行了系统而深入的研究。 

郑儒永院士

郑儒永,中国科学院院士,真菌学家。一直致力于真菌分类系统的合理化与完善。在国际上首次发现了高等植物中的内生毛霉,并首次报道了我国特有的人体病原毛霉新种和新变种。

庄文颖院士

庄文颖,女,汉族 1948727日出生于北京。研究员、实验室主任,菌物学专业。1988年毕业于美国康乃尔大学,获博士学位。主要从事菌物物种多样性与分子系统学研究。真菌学家。现任国际菌物协会执委会委员中国菌物学会常务副理事长、“生物多样性”副主编、国际刊物MYCOTAXONFUNGAL DIVERSITY的编委等职。

 

微生物对人类有利也有害,但人类的生存与生活离不开微生物!

 

四、 现代工业微生物学的兴起及其发展

大型发酵罐搅拌装置

人类社会经济发展的危机

 

工业微生物及其应用

4.1 工业微生物

工业微生物是指应用于发酵工业的微生物。发酵一词来源于拉丁语沸腾的派生词,用于描述酵母作用于果或麦芽浸出液时的现象。其实,这种沸腾现象是由果汁或麦芽浸出液中的糖在缺氧条件下被降解而产生二氧化碳引起的。

只有具备了这些条件的菌株,才能保证发酵产品的产量和质量,这既是发酵工业的最低要求,也是发酵工业的最大目的。

4.2 工业微生物的应用

氨基酸发酵:氨基酸发酵起始于1958年,其中谷氨酸是生产最早、产量最大的氨基酸。

氨基酸发酵所用的微生物主要是短杆菌和棒杆菌属的一些种,如黄色短杆菌、乳糖发酵短杆菌、北京棒杆菌、谷氨酸棒杆菌等。

抗生素发酵:20世纪40年代青霉素应用于临床以来,抗生素为人类的健康做出了卓越的贡献。

1928年英国科学家Fleming发现了在含金黄色葡萄球菌的平板上污染了青霉菌后,在青霉菌周围细菌不能生长的现象。他把这个青霉菌分离出来后再进行培养,发现其培养液能抑制各种细菌生长,并经动物试验证实其没有毒性,他依照青霉菌(Penicillum)的名字将其中的活性成分命名为青霉素(Penicillin) 

青霉素在临床上的奇异疗效,激发了世界各国有关学者的研究热情。

1944waksman发现了由链霉菌产生的链霉素用于治疗由细菌特别是结核杆菌引起的感染有特效。这个发现使人们对从土壤中寻找由放线菌产生的抗生素充满了信心。此后陆续发现了氯霉素、金霉素、土霉索、制霉菌素、红霉素、丝裂霉素C等,由此造就了抗生素发展的黄金时代。

微生物酶制剂发酵:酶是一种具有催化活性的蛋白质。20世纪40年代末,生产a一淀粉酶的深层液体发酵首先在日本实现了工业化生产,标志着现代酶制剂工业的开始。

酶制剂根据其来源可以分为动物、植物及微生物酶;依据其用途可分为工业用、分析用及药用。目前已有100多种酶能够大规模工业化生产,其中大部分是通过微生物发酵生产的。 

酶制剂的用途非常广泛,尤其是作为临床医疗、诊断和   分析用的酶制剂,是一个富有前景的领域,如链激酶(血栓、提高创伤和烧伤疗效)、己糖激酶(分析葡萄糖,诊断血糖及糖尿病)、乳酸脱氢酶(分析血清谷丙转氨酶,诊断病毒性肝炎、黄疸、急性心肌梗死)等。

有机溶剂和有机酸发酵:溶剂和有机酸都是微生物的初级代谢产物,与工业生产和人们的日常生活有着密切的关系,也是工业发酵中历史最悠久、吨位最大、价格最低的产品。

微生物生产的溶剂及其他化工产品包括酒精、丙酮、丁醇、丁二醇等。重要的微生物有梭菌,它能产生各种各样的有机溶剂,如丙酮、丁醇、异丙醇、丁酸等,常用的梭菌有丁酸梭菌、丙酮丁醇梭菌、糖乙酸丁醇梭菌。

有机酸在食品加工、医药、化工等领域的许多方面都有广泛的应用。发酵法生产有机酸涉及的微生物主要是细菌、霉菌等。有机酸中生产最早、产量最大的是柠檬酸。

核酸类发酵许多核苷酸类物质如5IMP5GMP等具有强化食品风味的功能,因此利用微生物发酵生产核苷和核苷酸的主要应用领域是在食品工业中作为风味强化剂。核苷、核苷酸及其衍生物的另一重要应用领域是用于临床治疗药物,如嘌呤类似物8氮鸟嘌呤和6巯基嘌呤具有与抗生素类似的功能,可以用于抑制癌细胞的生长。

目前工业上主要通过酶法水解RNA来生产核苷酸。RNA的来源很广,如啤酒厂的废酵母、单细胞蛋白及其他发酵工业的废菌体,其中以酵母中提取RNA为最常见。 

微生物多糖发酵: 微生物多糖在化工、医药方面的应用具有广泛的前途,如由甘蓝黑腐病黄单胞菌产生的黄原胶可用于石油工业和消防,也可作为增加食品黏度的添加剂;由大型真菌产生的多糖类物质则是传统的滋补性药物,具有抗癌功能。

微生物生理活性物质的发酵: 随着生命科学各领域的迅速发展,从微生物的代谢产物中寻找具有生理活性的物质(如酶抑制剂、免疫调节剂、受体拮抗剂和抗氧化剂等) 近几年的研究热点之一。这类物质是在抗生素研究的基础上发展起来的。

为了区别于一般抗 生素并强调其在医疗上应用的可能性,Monaghan等将这类物质称为生物药物素(biopharmacetin) 

维生素类生理活性物质发酵: 这类产品包括维生素AB2B12CD,以及一些维生素的前体,如维生素C的前体山梨醇,维生素A的前体β胡萝卜素以及维生素D的前体麦甾固醇等。

激素类药品、单细胞蛋白单细胞蛋白(SCP)是以烃类、酒精或工农业废物为原料,通过大规模培养酵母或细菌,取出细胞,经干燥和灭菌后可以作为人类食物或动物饲料。

环境净化微生物在环境保护中扮演着十分重要的角色,微生物法已经成为污水、废气和固体废弃物处理的主要方法。

4.3 微生物冶金

利用微生物进行石油脱硫、探矿、冶金是近年来研究和开发的一项新技术,特别是细菌冶金,适用于贫矿、尾矿和稀有矿的处理。

4.4食品发酵  

食品发酵是工业微生物最古老的内容,主要包括酿酒发酵和调味品发酵。

酒类饮料主要利用酵母菌发酵制作。酒类大致可以分发酵酒(啤酒、葡萄酒、绍兴滔)、蒸馏酒(白酒)和配制酒(药酒)。调味食品主要有酱油、豆酱、食醋、乳制品。酱油和豆酱是用酱油曲霉酿制的;食醋是用醋杆菌进行有氧发酵生产的;乳制品是用乳酸菌或和酵母混合发酵制备的。

5. 微生物遗传与育种

遗传学是生命科学领域中一门核心学科,主要研究遗传物质的结构与功能以及遗传信息的传递与表达。

经典遗传学主要研究遗传物质纵向传递的规律以及基因型与表型的关系。 

分子遗传学侧重研究基因的结构、功能和横向传递。结构是指遗传物质的化学本质与精细结构,功能是指遗传物质的复制、表达、调控、重组与变异。

群体遗传学研究群体中基因频率和基因型频率以及影响其平衡的各种因素。

与生命科学其他学科相比,遗传学具有以下特点:

①遗传学是一门推理性的学科。遗传学的研究方法是根据自然现象或实验数据推理出一种假设,然后通过实验加以验证。

②多学科交叉与融合。遗传学主要建立在生物化学、细胞生物学和统计学的基础上,但又涉及生命科学的各个领域。

③发展快。遗传学的发展非常快,新理论、新技术、新成果层出不穷。       

④应用性强,转化为生产力的周期短。以遗传学为理论基础,已派生出许多应用学科,如动植物及微生物育种学、优生学、生物工程学等。

5.1 遗传学的形成与发展
1 、孟德尔以前及同时代的一些遗传学说

公元前5世纪希波克拉底(Hippocrates)提出了第一个遗传学理论,他认为子代之所以具有亲代的特征是因为在精液或胚胎里集中了来自身体各部分的微小代表元素。

1809年拉马克(JBLarmarck)提出了用进废退的进化论观点并由此得出获得性状、(acquired characteristics)是可以遗传的。这是拉马克一生中最大的错误。

1866年达尔文(Darwin)提出了泛生论(hypothesis of pangensis)认为身体各部分存在一种胚芽或泛子(pangens)它决定所在细胞的分化和发育。

1883年威廉(WRoux)提出有丝分裂和减数分裂的存在可能是由于染色体组成了遗传物质,他还假定了遗传单位沿着染色体作直线排列。

1883年和1885年魏斯曼(Weismann)提出了种质论认为许多细胞可分为种质和体质两部分,种质是独立的、连续的,能产生后代的种质和体质。 

1869年高尔顿(FGalton)用数理统计方法研究人类智力的遗传。发表了天才遗传,认为变异是连续的,亲代的遗传性在子女中各占一半,并彻底混合,即融合遗传论。由于他所选择的研究性状是数量性状,所以虽然他的结论是正确的,但只适合于数量性状,不能作为遗传的普遍规律。

5.2 遗传学的诞生

在孟德尔以前就已经有一些植物学家做了植物杂交实验,并取得了显著的成绩。

1797年奈特(TKnight)将灰色和白色的豌豆进行杂交,结果杂交一代全部是灰色,而杂交第二代产生灰色和白色。

1863年诺丹发表了植物杂交的论文,他认为:①植物杂交的正交和反交的结果是相同的;②在杂种植物的生殖细胞形成时负责遗传性状的要素互相分开,进入不同的性细胞中,否则就无法解释杂种二代所得到的结果。

1866年奥地利遗传学家孟德尔(GJMendel)根据8年植物杂交实验,发表了植物杂交实验的论文(即现在的孟德尔分离定律和自由组合定律),但他的工作当时并未引起重视。直到1900年,狄夫瑞斯(HDevries)、科伦斯(CFJCorrens)和切尔迈克(EVTschermak)三位植物学家分别同时发现了这篇论文和它的价值,才使孟德尔学说重见天日,并建立了遗传学这门学科,这就所谓孟德尔定律的重新发现。

1901年狄夫瑞斯提出了“突变”这一名词。

1902SuttonBoveri首先提出了染色体是遗传物质的载体的假设。

19021909年贝特森先后刨用了遗传学(genetics)、等位基因(allele)、纯合体(homozygotls)、杂合体(hererozygotls)、上位基因(epistatic gene)等名词。

1909年约翰逊(Johannsen)创用了基因(gene)、基因型(genotype)和表型(phenotype)等名词。此时遗传学的雏形已形成,遗传学作为一门新的学科终于诞生了。

5.2 遗传学的发展

遗传学的发展大致可分为三个时期。

第一个时期是细胞遗传学时期(19101940)。此时期主要是确立了遗传的染色体学说。

1910年摩尔根(Morgan)和他的学生们用果蝇做材料研究性状的遗传方式,提出了连锁交换定律,并确定基因直线排列在染色体上。这样,就形成了一套经典遗传学的理论体系。经典遗传学的基本单位是一个不可再分而且是抽象的基因。

第二个时期是微生物遗传学和生化遗传学时期(19411969)。这一时期的特点是遗传学研究的对象从真核生物转向原核生物,并更深入地研究基因的精细结构和生化功能。

重大成果有一个基因一个酶的建立(BeadleTatum1941),遗传物质为DNA的确定(Avery1944)、跳跃基因的发现(RMe(1intock1951)DNA双螺旋结构模型的建立(WatsonCrick1953)、中心法则的提出(Crick1958)

此期间遗传的基本单位是顺反子(cistrons),它是具有一定功能的实体,在不同的位点上可以发生突变和重组。

第三个时期是分子遗传学时期,从1953年双螺旋结构模型的建立到现在。

此期间的主要贡献有乳糖操纵子模型的建立(JacobMonod1961),遗传密码的破译(NirengergKhirana1964),逆转录酶(Temin1975)DNA合成酶(Kornberg1958),限制性内切酶的发现(Arber1962年,1968年;Smith1978)DNA体外重组技术的建立(Berg1972)DNA测序(SangerGilbert1977),转座子的移动(Sharpino1980)核酶的发现(CechAltman1981)

PCR技术的建立(Swithies1986),内含子的发现(SharpRoberts1977),体细胞克隆羊的成功(wilmut1997)以及人类基因组计划的完成(199010月启动,20006月完成框架图,20022月完成精细图)

现在基因的概念是一段可以转录为功能性RNADNA,它可以重复、断裂的形式存在,并可转座。

  一是通过从不同生态环境中取样进行菌株分离和筛选,从广阔的自然界中获得新的菌种。分离微生物新种的具体过程大体上可分为采样、增殖、纯化和性能测定等步骤。

  二是对已有菌种进行遗传诱变,从中筛选获得具有优良性状的菌株。

传统的微生物遗传育种工作方法包括以下几种。

1、常规育种/自然选育

2、诱变育种

根据育种需要,有目的地使用诱变因素,可使菌株的基因发生突变以改良其生产性状。目前用于微生物诱变育种的因素有紫外线、激光、X射线、Y射线、快中子等物理因素和烷化剂、天然碱基类似物、亚硝酸和氯化理等化学因素。在物理诱变因素中,紫外线比较有效、实用、安全,其他几种射线都具有用高性质,具有穿透力,使用时有一定的危险性。化学诱变剂的突变率通常要比电高辐射高,并且经济实用,但这类物质多为致癌剂,使用的必须谨慎。目前,许多诱变剂的诱变效果、作用时间、方法都已基本确定,人们可以有目的、有选择地使用各种诱变剂,以达到预期的育种效果。

3、杂交育种 

杂交育种选用了已知性状的供体菌和受体菌作为亲本,所以不论是方向性还是自觉性,均比诱要有种前进了一大步。

另外,杂交育种往往可以消除某一菌株在诱要处理后所出现的产量上升缓慢的现象,因而是一种重要的育种手段。但杂交育种方法较复杂,许多工业微生物有性世代不十分清楚,因而不像诱变育种技术那样得到普遍推广和使用。直到1978年第二届国际工业微生物遗传学讨论会上提出了原生质体融合技术后,杂交育种技术才获得了飞速的发展。在渗透压稳定剂存在下,利用溶菌酶或溶壁酶将微生物细胞壁溶解,可制备得到原生质体。原生质体同时融合可以被化学诱融剂如聚乙二醇(PEG)所诱导。而电融合技术在细菌中报道比用PEG诱导的融合频率要高得多。

4、基因工程育种 

广义的基因工程为代谢工程

代谢工程作为各学科间的交叉研究领域,利用现代遗传学工具对代谢途径进行修饰以促进细胞的性状也日益显现出卓越的成效。

代谢工程着眼于对原核生物和真核生物系统初级代谢途径的修饰,发展新的工具并引入对微生物和其他生物的遗传控制,对改变了的细胞生理进行评估。利用了数学

方法以推导代谢途径的结构,以及在代谢途径中的动力学分配。利用NMR做磁共振)波谱和气相色谱质谱法探测示踪化合物富集和进行同位素质量测定,利用代谢物和同位素平衡的方法在体内确定细胞内代潮流的走向和分布。

该领域的进一步发展得益于基因组学、蛋白质组学和其他新的技术,如探查细胞表达表型的DNA微阵列技术的发展。

狭义的分子育种”(molecular breedng指有效地对亲本性质进行重组而在子代群体中产生极大的多样性。是对现存的多样性进行有效重组以设计具有多项功能参数的生物系统的有力的工具。

微生物分子育种是指运用微生物分子遗传学原理,利用基因工程、细胞工程和代谢工程等现代化技术对某种具有特定生产目的的微生物菌株有目的地改造,消除不良性状,增加有益的新性状,以提高产品的产量和质量的一种新的有种方法。

5.3 微生物分子育种

(一)发展史和主要研究领域

20世纪70年代以来,快速发展的基因工程操作,直接提供了在基因水平上改造微生物菌株性状的方法。

近二十年采,基因工程育种技术在许多方面都有突破性的进展,从获得目的基因的方法、不同生物种类的基因表达系统、筛选重组子的方法等了一系列行之有效的克隆、表达方法,建立了多种表达和分泌的系统。

20世纪70年代以来,快速发展的基因工程操作,直接提供了在基因水平上改造微生物菌株性状的方法。

各种杂交技术、PCR(聚合酶链反应技术、基因芯片和蛋白质芯片技术、各种分析技术、高通量筛选技术、生物信息学等多样新技术、新方法、新理念的提出、应用与发展,加速了微生物分子育种的步伐。 

许多优良的工业微生物菌种被选育出来,并被用于国内外的工业、农业和环境保护等领域。

应用微生物分子育种技术所获得的菌株大多用于多种酶、维生素、氨基酸、激素、抗生素以及其他一些次生代谢物质的生产。

改良后的微生物用于环境保护降解多种非天然化学物质,用于植物保护、杀灭植物病害等方面取得了令人瞩目的进展。

生物制药工业

  1975年生产了第一个单克隆抗体.   

  1977年人类基因在细菌中得到表达,鼠胰岛素基因被克隆。

  1979,杂合的酵母,大肠杆菌穿梭载体对酵母原生质体的转化成功。

  1984年,Chiron克隆了人免疫缺陷病毒(HIV 基因组并进行了序列测定。

 1986年,α干扰素和第一个重组B型肝炎疫苗被批准生产,1987年组织血纤维蛋白溶酶原激活因子被批准生产。

人类基因组计划始于1988年,在这一年批准了第一个转基因动物专利。

 1991年,粒细胞克隆刺激因子(GCSF)被批准。

 1992年批准因子。一年后,β-干扰素获得批准。

重组DNA技术被应用于初级代谢研究领域。

 重组大肠杆菌产生的丙酮产率可达9g/L,比丙酮丁醇羧菌还要多。

大肠杆菌还被改造为优秀的乙醇生产菌株(LOIngram1987),产乙醇达43%(体积分数

采自运动发酵单胞菌(Zsmomonas mobilis)编码醇脱氨酶 和丙酮酸脱羧酶的基因转入大肠杆菌;成为NAD再生的主要系统。

DNA芯片的应用

DNA芯片作为微型化高通量的平行分析设备,有利于检测微生物在特定生理状态(如对高产率有利的状态)下特征性基因的差别表达,结合PCR扩增技术,通过标记探针和分子杂交反应,可以进行定量的基因表达分析。

高通量筛选(High throughput screeningHTS)技术是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础,以微板形式作为实验工具载体,以自动化操作系统执行试验过程,以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据,以计算机分析处理实验数据,在同一时间检测数以千万的样品,并以得到的相应数据库支持运转的技术体系,它具有微量、快速、灵敏和准确等特点。

简言之就是可以通过一次实验获得大量的信息,并从中找到有价值的信息。 

对生物制药所作的努力主要还是在选择对重组DNA适宜的宿主菌方面。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)在工业发酵中具有长期的历史,该菌可以分泌外源蛋白到培养基中,以及可以产生单细胞细菌所不能产生的糖基化蛋白质,因而也是生产外源蛋白常用的宿主菌。另外,其核细胞可以进行转录后修饰。

在很多实验应用中,采用了更高等的真核生物如昆虫细胞培养物生产重组蛋白。

在一些发生错误糖基化(例如有的用酵母菌和昆虫细胞培养物时)的例子中,采用了哺乳动物细胞来生产蛋白质。

重组DNA技术用于生产工业用酶是件很自然的事情,因为通常这些酶都是由单个基因产生的。

随机突变可以使酶的性质产生多样性变化,定位诱变日经成为改良酶性质的一种常用技术。

酶的定向进化技术

  该技术采用了多样化的方法随机性产生大量突变酶,包括通过DNA改组(DNA shuffling)、易错PCR或增变菌株产生酶的突变体,然后通过强有力的选择或筛选技术从突变文库中筛选得到最好的突变体。DNA改组通过把来源于不同生物的相似基因汇集在一起,用限制性内切酶酶切、重组,形成数百个新的个体。该方法模仿了自然界的突变、选择和重组过程以获得高度适应性的蛋白质,但比自然界的过程要快得多。最有兴趣且意义重大的是对人和其他生物基因组的测序。

 微生物基因组学研究的重点已由结构基因组学转向功能基因组学。微生物功能基因组学不仅要阐明微生物基因组内每个基因的功能,还要研究基因的调节及表达谱,进而从整个基因组及全套蛋白质产物的结构、功能、机理的高度去了解微生物生命活动的全貌,揭示微生物世界的规律,并使之为人类社会服务。

与真核生物相比,虽然微生物的基因组相对简单,但仍具有重大的科学和经济意义。

可以预测,基因组序列将导致许多新的药物的发现,将来的制药工业不仅提供药物,而且提供基因、细胞和组织器官。

希望这种努力可以预防和/或治疗一些复杂的疾病,例如阿尔茨海默型老年痴呆症、帕金森病、癌症。艾滋病和很多遗传性紊乱病。

5.4 微生物分子育种展望

近二十年来,随着分子遗传学和分子生物学各顶新技术的快速发展,微生物分子育种领域已经得到长足的进展,人类可以逐步按照自己的设计对微生物进行改造,使其更好地为人类造福。

1、微生物育种新方法新技术的发展

目前,各种分子生物学、生物化学和生物物理学的新技术、新方法不断发展与涌现,包括基因芯片技术、微阵列技术、荧光定量实时检测技术、蛋白质双向电泳技术、各种图像检测和分析平台技术、多维液相色谱技术、基质辅助激光解吸附飞行时间质谱技术、表面等离子共振技术等多种大规模、高通量检测、分析技术与仪器的问世和逐步推广,对微生物分子生物学和微生物分子育种起到了极大的直接或间接的推动作用。

微阵列技术

一种研究有多少基因能相互作用以及一个细胞网如何同时控制大量基因的新方法。这种方法利用机械手精确地将大量DNA分别点到载玻片上。研究者然后从他们研究的细胞中提取的DNA标上荧光标记。标记探针能与载玻片上的DNA互补连接。将载玻片放入扫描仪下,测量每个荧光点的亮度,亮度反映了特定DNA片段存在的量。 

基质辅助激光解吸附飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)是蛋白质组应用研究的最佳仪器,高质量的MSMS/MS (PSD)数据通过数据库的自动搜索就可以得出极可靠的结果。无法比拟的灵敏度可以对双向电泳中最弱点进行准确分析。

应用领域:主要对多肽、蛋白质、核苷酸、糖蛋白、多糖及高聚物进行检测和鉴定。 

Time of Flight Mass Spectrometer (TOF) 是一种很常用的质谱仪。这种质谱仪的质量分析器是一个离子漂移管。由离子源产生的离子加速后进入无场漂移管,并以恒定速度飞向离子接收器。离子质量越大,到达接收器所用时间越长,离子质量越小,到达接收器所用时间越短,根据这一原理,可以把不同质量的离子按m/z值大小进行分离。飞行时间质谱仪可检测的分子量范围大,扫描速度快,仪器结构简单。这种飞行时间质谱仪的主要缺点是分辨率低。 

表面等离子共振仪  

仪器特点
表面等离子共振(SPR, Surface Plasmon Resonance)是用于表征表面折射系数改变的光学专业技术所说的表面一般是固相和液体间的界面。

SPR应用领域包括:薄膜、自组装单分子层的形成及性质,蛋白质、核苷、医药品、表面活性剂等分子间的交互作用。 

基于表面等离子体共振技术((Surface plasmon resonanceSPR),又称表面等离子体子共振,表面等离激元共振,是一种物理光学现象)的表面等离子体共振仪是已经成为物理学、化学和生物学研究的重要工具。

当入射光以临界角入射到两种不同折射率的介质界面(比如玻璃表面的金或银镀层)时,可引起金属自由电子的共振,使一部分光能量在金属表面发生迁移,从而使反射光在一定角度内大大减弱。其中,使反射光在一定角度内完全消失的入射角称为SPR角。SPR随表面折射率的变化而变化,而折射率的变化又和结合在金属表面的生物分子质量成正比。因此可以通过获取生物反应过程中SPR角的动态变化,得到生物分子之间相互作用的特异性信号。 

进一步发展有效技术,利用分子遗传学和分子生物学技术建立并完善各种宿主菌的遗传转化及分泌、表达系统;

通过开展基因组学、蛋白质组学、转录组学和代谢网络的研究,从全局的水平上了解基因表达调控的规律

采用高通量筛选技术进行基因组定位进化、代谢途径工程、蛋白质工程等对蛋白质和菌株进行有目的改造,已经成为微生物分子育种领域的发展趋势。

代谢工程;又称途径工程(path-way engineering)。是基因工程的一个重要分支。细胞的代谢网络至少是由上千种酶、膜传递系统、信号传递系统所组成的,同时它又受到精密调控且互相协调的复杂系统,因此代谢工程一般是多基因的基因工程。

通过基因工程的手段来改变分叉代谢途径的流向或阻断有害代谢产物的合成等原理,来改变微生物代谢的流向,增加某些产物的产量,也可通过引入外源基因来延伸原来的代谢途径,产生新的末端代谢产物,或者利用新底物作为生物合成的原料,也可以通过构建新的代谢途径合成具有新化学结构的代谢产物。
2、加强对微生物菌株资源和基因资源的开发和利

近年来,国内外对极端微生物和极端酶的研究进展很快。日本、美国和欧洲的一些国家纷纷投资开展海洋极端微生物和极端酶的研究,从海洋极端微生物获得了嗜冷α一淀粉酶、枯草芽孢杆菌蛋白酶、

嗜热淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖甘酶、木聚糖酶、DNA 聚合酶、耐盐蛋白酶、谷氨酰胺酶、耐有机溶剂的菌株,利用海洋蓝细菌Anabaena Species TU371在氮气和氮气环境中光合作用产氢、从海洋链霉菌中分离到抗赤腐病原菌 Pythium PorPhyrae  引起紫菜属赤腐病的抗真菌蛋白等。

最令人振奋的是美国的文特尔等人在马尾藻海的细菌中发现了121万余种基因,超过以前公共数据库所列微生物种基因的总数,全新基因达7万余种。其中,有782个基因蛋白质产物对光敏感,还发现约5000个新基因的功能涉及氢能的开发。整个进展情况都显示了开发海洋微生物基因资源的重要性和紧迫性。

马尾藻海 

马尾藻海又称萨加索(葡语葡萄果的意思)海,是大西洋中一个没有岸的海 ,又称“洋中之海”。

马尾藻海上大量漂浮的植物马尾藻属于褐藻门马尾藻科,是最大型的藻类,是唯一能在开阔水域上自主生长的藻类。 
3、采用分子方法发现难培养微生物

批量 DNA克隆法(bulk DNA cloning),即提取环境样品的总DNA,用限制酶消化后克隆到入载体上。用这种方法所建立的基因组文库在回收不同分类成员的rRNA时排除了选择倾向。但在实践中,这种方法的主要缺点是DNA文库的多数成员不会有rRNA基因。

进一步发展的快速而有效的方法是采用 16S rRNA基因专一性引物,通过PCR介导进行 16SrRNA基因或基因片段的扩增(可以利用环境样品中的rRNArDNA),然后克隆到大肠杆菌中,分离个别的基因拷贝。采用这种程序所建立的 16S rRNA基因的群体库可以进一步通过样品克隆、限制酶消化、观察对专一性探针的反应或者进行全部或部分序列测定等方法采进行序列比较。

4、高通量筛选和基因芯片技术 

高通量筛选high throughput screeningHTS)体系适于进行高通量筛选的基因表达体系有多种,其中酵母细胞是主要的表达体系。

用于HTS的吸测方法多以酶联免疫吸附分析(ELISA)方法为基础,目的在于确定配基和受体的相互作用。常采用荧光或酶标比色法代替同位素标记法进行检测。

以基因表达产物为靶位建立的药物筛选模型与传统模型相比,具有以下优点:

靶位专一、特异性强;

通过基因克隆扩增可以获得足够量的靶位物质;

与采用动物及其组织提取物的方法比较,费用明显降低;

所建立的模型适于HTS全自动快速大量筛选的新体系。

近年来微生物基因组学的发展,为高通量寻找药物靶位提供了新的研究思路,即首先应用生物信息学技术寻找微生物的保守基因,再用基因灭活技术从保守基因中寻找微生物生长的必需基因,并以此作为候选药物靶位。最后,应用综合方法对这些靶位进行筛选,寻找新微生物药物的候选分子或化合物。

用重组DNA技术导入定向改造的基因,以改进微生物细胞的某些代谢特性,已经发展成为工业微生物育种和发酵过程优化的强有力的工具。

基因的修饰与表达是代谢工程的重要组成部分。基因组学和各类分析技术的发展促进了代谢工程领域的迅猛发展。

基因组的顺序可以提供对个别基因和整个途径的转录控制有重要作用的基因和基因内部控制元件的信息。

利用微型化高通量的DNA芯片技术可以鉴别特定生理状态下差别表达的基因。结合PCR技术,通过标记探针和分子杂交反应可以对基因表达进行定量分析。

DNA芯片技术可用于基因突变的检测、基因多态性分析和基因图谱的绘制等,用途十分广泛。

表达谱芯片技术可以检测微生物不同菌株之间或同一株菌在不同的生理条件下基因的差异表达情况,如营养条件、离子强度、极端pH值的细胞应答、细胞密度依赖的基因表达、低氧和高氧的基因调节和休眠诱导、病原体和宿主的相互作用、不同遗传背景菌株基因的表达差异等。可以说DNA芯片技术具有十分巨大的应用潜力。

5 生物信息技术

生物信息学是采用计算机技术和信息论方法研究生命科学中各种生物信息的表达、采集、储存、传递、境索、分析和解读的科学,是现代生命科学与信息科学、计算机科学、数学、物理学、化学等学科交叉渗透形成的新兴前沿学科。生物信息学具有把基因组序列数据翻译成知识的潜力。

生物信息学技术直接指导对新基因和新的结构功能域的发现、对代谢途径工程的设计、对突变酶的设计与改造等,在多方面发挥了重要的作用。可以预见,生物信展学技术在微生物分子育种领域具有越来越广泛的应用。 

CGustafsson等人(2003)指出,在蛋白质工程领域也存在复杂的多变量问题。在其他工程领域发展起来的数学和数据挖掘工具现在已经被应用于进行催化剂设计、分析肽和蛋白质的序列与活性的关系,帮助设计具有特定性质的新肽和新蛋白质等。

在开展蛋白质工程时,采用生物信息学方法可以指导对生物催化剂的定点突变进行理性设计。在生物信息学技术的指导下,已经对枯草杆菌蛋白酶、二氢叶酸还原酶、核糖核酸酶、胰蛋白酶等许多种类的蛋白质进行了定点突变改造。

在我国,微生物分子育种的研究和应用无论在工业、农业或环境保护诸方面都已经获得引人瞩目的进展。

例如在微生物农药方面,除了杀虫与防病细菌制剂以外,对杀虫病毒、真菌和农用抗生素等方面都开展了研究,尤其在与社会经济发展关系重大的环境与特殊微生物的研究方向国家已给予重视。

研究内容除农业环境污染以外,还涉及工业、城市、水域等重要污染物降解的微生物技术,对近年来成为国际研究热点的难培养和极端环境微生物资源的开发利用也加强了研究的投入,并已取得了多项重要的研究和应用成果,显示出微生物生物技术的巨大潜力和广阔的应用前景。

第二章 微生物的多样性及其基因资源

微生物是地球上生物多样性最为丰富的资源。其生物多样性在维持生物圈和为人类提供广泛而大量的未开发资源方面起着主要的作用。
    微生物的多样性包括微生物的生活环境、物种、形态、结构、生理代谢类型、微生物与生物环境间的相互关系、遗传等方面的多样性。

1.1 微生物的多样性

人类利用微生物加工食品具有古老的历史,近代应用微生物生产有用产物已建立多种生物技术产业。

为了持续开发微生物产物,造福社会,人们必须寻找更多类型的微生物,通过研究,获得新的产物。显然,寻找新的微生物成为持续发展微生物技术的首要工作。

因此,对微生物在自然界存在的场所,所谓生境(habitat)须有所认识(1-1)

微生物种类繁多,包括细菌、真菌、病毒、单细胞藻类和原生动物。

在生物圈中,微生物分布范围最为广泛,一般生物不能生存的极端环境,如高温泉、大洋底层、高酸、高碱、高盐水域都有极端微生物生活。

微生物在生物圈的物质循环中起着关键作用,对人类生活和社会发展也起着其他生物不能替代的作用。

   微生物生活环境:

地球上,除了火山中心区域外,从土壤圈、水圈、大气圈直至岩石圈,到处都有微生物的踪迹。甚至在极其恶劣的环境中也可找到微生物,如万米高空中,万米海底,数百米岩石中均有微生物生存

1.2 多样性的广度

从表1-2数字可以看出,人们对低等生物种类知之甚少,对细菌、古细菌和病毒总数的估计很有问题,因为从环境中分离和培养它们是困难的,特别是对于专性寄生性种类。

为什么会出现这一种情况?主要是人们在实验室所设计的培养基和培养条件还不能重复生境中的条件,还不适合各种微生物生长的需要。

但是,已有多方面的论据,指明生境中微生物是极为丰富的。

微生物的物种:目前发现的微生物物种共有10万种,随着分离、培养方法的改进和研究工作的深入,微生物的新物种、新属、新科甚至新目、新纲屡见不鲜。

1.3 原核生物是未曾观察到的多数

美国Georgia大学微生学系、生态学系和深海科学系几位专家对地球上原核生物作了估算,他们的结论是:原核生物是未曾看到的多数(the unseen majority)

人类对微生物物种多样性的了解最为贫乏: 以原核生物界为例,除少数可以引起人类、家畜和农作物疾病的物种外,对其它物种知之甚少。已知种占估计种的比例从下面的两张统计表中可以看出。

中国微生物已知物种数与世界已知物种数的比较

微生物的已知种数和估计总种数

1.4 绝大多数微生物还不能培养

美国微生物学家Colwell的实验室在1982年提出不能培养的微生物的概念。

Colwell编辑专著Nonculturable Microorgani- sms in the Environment (1999),总述各个领域里不能培养的微生物的研究结果。到目前人们共同的认识是生境中存在的微生物中不能培养的占绝对多数 

1.5 微生物资源的保护和开发 

微生物受威胁状况:

  一些野生食用和药用菌,由于过度采收造成资源日益枯竭。

  例如冬虫夏草(Cordyceps sinensis),仅分布中国青藏高原高海拔地区,50年代前后年产在20000kg以上,由于严重滥采,产量逐年下降,真品少,掺杂不少霍克斯虫草(Cordyceps hawkesii)或其他虫草。

微生物资源的开发:

微生物资源的开发,是21世纪生命科学生命力之所在。由于动植物物种消失是可以估计的,这就意味着微生物多样性的消失现象也在发生,如何利用和保护微生物多样性已成为亟待解决的问题。 

近年来,世界各国和国际组织已对此做了许多努力,并提出了一项微生物多样性行动计划 

微生物多样性行动计划:

建立推动微生物多样性研究的国际组织; 

召开关于微生物的概念和分类指征研讨会; 

提出已知种的目录; 

发展微生物分离、培养和保藏的技术; 

发展微生物群落取样的标准; 

提出选择自然保护区和其它需要长期保护的生态系等。

1.6 中国微生物多样性的保护 

中国已建立的数百处自然保护区同时也为真菌提供了就地保护的良好场所。 

发展林业是木生食用菌、药用菌、菌根菌和地下块菌资源可持续利用的根本保证,与此同时要实行计划采收,以达到保护资源,林菌并举,获得最佳经济效益的目的。

菌种保藏是迁地保护的一种方法。中国科学院微生物研究所菌种保藏室共保藏菌种1万余株。目前中国菌种保藏工作跟实际需要还有很大距离,应该结合物种多样性调查对各种野生菌进行分离、培养和保藏。 

已知菌种来源和菌种保藏中心

1.7 微生物多样性图例

Bacillus anthracis 
炭疽杆菌

Esherichia coli 
大肠杆菌

Enterococcus faecium
屎肠球菌

Staphylococcus aureus
金黄色葡萄球菌

肺炎链球菌
Streptococcus pneumoniae

Vibrio cholerae
霍乱弧菌 

破伤风梭菌
Clostridium tetani

细菌荚膜

梅毒螺旋体
Treponema pallidum 

Streptomyces lividans 1326
浅青紫链霉菌 

Streptomyces lavenduale NRRL 2564
淡紫灰链霉菌 

支原体

立克次氏体——细胞内寄生

立克次氏体——线粒体的祖先

衣原体Chlamydis

粘细菌myxobacteria

蛭弧菌

酵母菌yeast

青霉

黑曲霉的分生孢子头

曲霉引起脑和皮肤感染

曲霉感染脑部

仙女圈

地衣

蘑菇 Agaricus campestris

木耳 Auricularia auricula

冬虫夏草 Cordyceps sinensis

红毛盘菌 Scutellinia scutellata

松乳菇 Lactarius deliciosus

松口蘑  Tricholoma matsutake

白黄蜜环菌 Armillaria albolanripes

黄绿蜜环菌 Armillaria luteo-uirens

粪鬼伞 Coprinus sterqulinus

灵芝 Ganoderma lucidum

烟草花叶病毒的电镜及模式图

乙肝病毒电镜及模型

病毒的个体形态

二十面体病毒

变型的二十面体衣壳

 

 

2. 微生物基因组与基因资源

基因组的概念

基因组(genome)这个名词最早于1922年出现在遗传学的文献中,指的是单倍体细胞中所含的整套染色体。所以genome这个名词又被译为染色体组。近年来,学术界更多的把genome定义为整套染色体中所包含的全部基因。基因组这个名词逐渐代替了染色体组。

基因组(genome)是指存在于细胞或病毒中的所有基因。基因组通常是指全部一套基因。

由于现在发现许多非编码序列具有重要的功能,因此目前基因组的含义实际上是指细胞中基因以及非基因的 DNA 序列组成的总称,包括编码蛋白质的结构基因、调控序列以及目前功能还尚不清楚的 DNA 序列。

但无论是原核还是真核微生物,其基因组一般都比较小(表 8 - 1 ) ,其中最小的大肠杆菌噬菌体 MSZ 只有 3000bp,含 3 个基因。

生物基因组的特点

1.原核微生物基因组的特点

1)结构简单,原核DNA分子的绝大部分是用来编码蛋白质的,只有非常小的一部分不转录,这与真核DNA的冗余现象不同。

2)存在转录单元,原核生物DNA序列中功能相关的RNA和蛋白质基因,往往丛集在基因组的一个或几个特定部位,形成功能单位或转录单位。

3)有重叠基因,长期以来,人们认为基因是一段DNA序列,这段序列负责编码一个蛋白质或一条多肽。但是,已经发现在一些细菌和动物病毒中有重叠基因,即同一段DNA能携带两种不同蛋白质的信息。

2.真核微生物基因组的特点

在真核细胞中,染色体的形状较小,不同生物的染色体数差别很大

微生物操纵子的存在使微生物生长因子现象变得容易解释,例如在微生物发酵青霉素的工业实践中,往往在发酵液中添加玉米浆,研究发现,玉米浆中有苯甲酸和苯甲胺类物质充当中间体。这类物质可以认为是青霉素发酵中的效应物。

一般来说,这些依赖于宿主生活的病毒基因组都很小。

近年来对微生物基因组序列的测定表明,能进行独立生活的最小基因组是一种生殖道支原体,只含 473 个基因,通过与流感嗜血菌序列比较研究,提出了 256 个基因可能是维持细胞生命活动所必需的最低数量的假说。

(一)大肠杆菌的基因组

大肠杆菌基因组为双链环状的 DNA 分子,在细胞中以紧密缠绕成的较致密的不规则小体形式存在于细胞中,该小体称为拟核( nucliod ) ,其上结合有类组蛋白蛋白质和少量 RNA 分子。

基因组全序列测定于 1997 年由 Wisconsin 大学的 Blattner等人完成,其基因组结构特点如下:

1.遗传信息的连续性

大肠杆菌和其他原核生物中基因数基本接近由它的基因组大小所估计的基因数(通常以 1 000 bp -1 500 bp 为一个基因计),说明这些微生物基因组 DNA 绝大部分用来编码蛋白质、 RNA ;用作为复制起点、启动子、终止子和一些由调节蛋白识别和结合的位点等信号序列。 

2.功能相关的结构基因组成操纵子结构

大肠杆菌基因组测序推测出 2192 个操纵子。其中 73 %只含一个基因, 16 . 6 %含有 2 个基因, 4 . 6 %含有 3 个基因, 6 %含有 4 个或 4 个以上的基因。 

3.结构基因的单拷贝及 rRNA 基因的多拷贝

在大多数情况下结构基因在基因组中是单拷贝的,但是编码 rRNA 的基因往往是多拷贝的,大肠杆菌有 7  rRNA 操纵子,其特征都与基因组的复制方向有关,即按复制方向表达。 

4.基因组的重复序列少而短

原核生物基因组存在一定数量的重复序列,但比真核生物少得多,而且重复的序列比较短,一般为 4 - 40 个碱基,重复的程度有的是十多次,有的可达上千次。

(二)詹氏甲烷球菌的基因组

詹氏甲烷球菌Methanococcusjannnnaschii 属于古生菌该菌发现于 1982 年。生活在 2600m, 2.63Xl07Pa ( 260 个大气压, 94 ℃ 的海底火山口附近。 

1996 年由美国基因组研究所 The lnstitute for Genomiic Research 简称 TIGR 和其他 5 个单位共 40 人联合完成了该菌的基因组全测序工作。这是完成的第一个古生菌和自养型生物的基因组序列。根据对该菌全基因组序列分析结果完全证实了 1977 年由 Woese 等人提出的三界学说。因此有人称之为“里程碑”的研究成果。

从目前已知的詹氏甲烷球菌和其他古生菌的基因组全序列分析结果来看,几乎有一半的基因通过同源搜索在现有的基因数据库中找不到同源序列。例如詹氏甲烷球菌只有 40 %左右的基因与其他二界生物有同源性,其中有的类似于真细菌,有的则类似于真核生物,有的就是二者融合。

可以说古生菌是真细菌和真核生物特征的一种奇异的结合体。

原核微生物的基因调控:原核微生物的基因调控系统有很多种,但对微生物生产实践有指导意义的主要是操纵子学说。

操纵子学说是由法国巴斯德研究所著名科学家JacobMonod1961年首先提出,并在十多年间经过许多科学家的补充和修正得到逐步完善。

操纵子的主要结构组成:

原核生物的基因调控系统是由一个操纵子 和它的调节基因所组成。每个操纵子又包括三种功能上紧密相关的基因结构基因,操纵基因,和启动基因。

操纵子的主要分类:

1 负控诱导系统,阻遏蛋白不与效应物(诱导物)结合时,结构基因不转录。

2 正控诱导系统,效应物分子(诱导物)的存在使激活蛋白处于活性状态

3 负控阻遏系统,阻遏蛋白与效应物结合时,结构基因不转录。

4 正控阻遏系统,效应物分子的存在使激活蛋白处于非活性状态。

乳糖操纵子的诱导机制

代表 以乳糖的负调节(negative  control)为例

抑制调节:在缺乏乳糖诱导时,其调节蛋白--阻遏物一直结合在乳糖操纵基因上,抑制结构基因的转录

诱导调节:即调节蛋白与结合而变构,阻遏物丧失与乳糖操纵基因的亲合力,操纵子打开,转录与转译进行

关闭基因:当诱导物耗尽,阻遏物又关闭基因

乳糖操纵子的正调节(positivecotrol)

结合启动:即当调节蛋白(CRP:  cAMP受体蛋白)降解物激活蛋白(CAP)直接与启动基因结合则是正调节起始之时

转录与转译RNA多聚酶结合到DNA上转录启始位点,则转录与转译顺利进行。 

强化诱导 CRPcAMP相互作用,则能提高CRP与启 动基因的亲和力而强化诱导。

(三)啤酒酵母的基因组

啤酒酵母是单细胞真核生物,1997年,由欧洲、美国、加拿大和日本共 96 个实验室的

633 位科学家的艰苦努力完成了全基因组的测序工作,这是第一个完成测序的真核生物基因组。该基因组大小为 13.5 X 106bp ,分布在 16 个不连续的染色体中(表8 - 2)。 

(四)土壤和水样中DNA及多样性研究

土壤和海水浮游微生物提取DNA已有成熟方法。

土样DNA可采用回收细胞和裂解,或者直接裂解,而用碱性缓冲剂抽取。所得DNA须再经纯化。如加入PVP(pvplyvinylpyrrotidone聚乙烯吡咯烷酮)去除腐殖酸物质,是必要的步骤。从l00 g土样可获得l mg经纯化的DNA,足够进行多样性比较研究。

(五)土壤微生物 DNA 的文库构建

1998  Wisconsin 大学的学者与一家制药公司开始了土壤 DNA 文库构建。他们从波士顿附近的土样抽取 DNA ,再将大片段 DNA ( 100-300kb )插人 BAC 载体,再转化到 E . coli ,获得重组文库(图 1- 5 ) ,并对土壤微生物群体的基因组命名为偏基因组 ( metagenome )。

细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome

将土样中不能培养微生物 DNA 的大片段( DNA > 50kb )连接于 BAC ,重组载体转化 E . coli

上述学者从所构建的偏基因组文库中找出一百多个 16SrRNA 基因,显示序列的广阔多样性,其中有的与已知细菌群相近,但大部分的序列代表了未经鉴定的细菌。

 70 个序列组成系统进化树,如图 1- 6 所示。图中注有种名的序列均从构建的偏基因组中找出。

 

3. 生物多样性保护与人类生存的关系

生物多样性是指各种生命形式的资源,它包括数百万种的植物、动物、微生物、各个物种所拥有的基因和由各种生物与环境相互作用所形成的生态系统以及它们的生态过程,是物种多样性、遗传多样性、生态多样性、景观多样性的总和,是所有生命系统的主要特征之一。

生物多样性保护就是要保护地球上一切生物资源及人类的生存环境。我们的衣、食、住、行及物质文化生活在许多方面都与生物多样性有着密切的关系,:食物、纤维、木材、药材和多种工业原料等,特别是食物是无法用化学合成产品取代的。

今世界上正面临着人口、资源、环境、粮食与能源五大危机,这些危机的解决都与地球上生物多样性有着密切的关系,但是目前生物多样性正以惊人的速度丧失。 

生物多样性保护与可持续发展:

各种各样的生物资源为人类生存、发展提供了物质墓础,保护生物多样性是建设可持续发展社会的需要. 由于人类活动的加剧,引起全球环境的迅速恶化,可持续发展正面临生物多样性急剧减少的危机. 当前应通过宣传和教育,加强法制建设,控制人口,依靠科技进步等来保护生物多样性,以实现可持续发展.

生物多样性(Biologlcal DiversityBiodiversity)是指生物所有来源的活的生物体中的变异性这些来源除其它外包括陆地、海洋和其它水生生态系统及其所构成的生态综合体这包括物种内、物种之间和生态系统的多样性。

生物多样性是自然界赋予的巨大财富,这笔自然财富对维持人类的生存与发展有着无可替代的重要意义. 然而,由于人类活动的加剧,引起了全球环境的迅速恶化,致使地球上的生物多样性不断减少,大量物种趋于灭绝,人类生存的基础正在逐渐瓦解.保护生物多样性已成为当前全世界关注的热点.

生物多样性的功能:

生物多样性包括遗传、物种、生态系统与景观多样性。从以下几个方面综述了生物多样性的功能:稳定生态系统的作用;提高生态系统生产力的作用;生物多样性对生态系统可持续性的作用;生物多样性在农业生产上的作用;生物多样性在医学上的作用;生物多样性在工业上的作用。

生物多样性与生态系统功能:最新的进展与动向生物多样性与生态系统功能的关系及其内在机制是当前生态学领域的重大科学问题。2002年以来人们不再过多地纠缠于“抽样-互补之争,对这一世纪课题的认识又有了新的进展。

(1)人们开始运用已有的知识揭示更大时间和空间尺度上的物种多样性-生态系统功能关系;

(2)非生物因素与多样性-生产力的交互关系吸引了许多实验研究。人们发现:物种多样性-生产力关系可能会受到资源供给率和环境扰动的修正,环境因素可能是多样性-生产力关系的幕后操纵者;

(3)人们开始重视营养级相互作用对于多样性-生态系统功能关系的影响;

(4)人们开始认真思考物种共存机制在多样性-生态系统功能关系的形成中所扮演的角色。

理论模型研究表明,不同的物种共存机制会导致不同的多样性-生产力关系。

 

 

 

 

 

第三章 重要的工业微生物

工业上重要细菌及其应用 

Escherich属菌株和大多数大肠杆菌是无害,但也有些大肠杆菌是致病的,会引起腹泻和尿路感染。  

O-157(肠胃出血性大肠杆菌)本身对人无害,获得新基因产生溶血菌素破坏人体的红血球、血小板和肾脏组织。

有鞭毛的大肠杆菌的菌体在医学上称O抗原”,根据其性质不同,可将所有大肠杆菌分为173类,O-157即指编号为157的大肠杆菌O抗原。

大肠杆菌的名声主要因它易于在实验室操作、生长迅速,而且营养要求低。

应用:

大肠杆菌能作为宿主供大量的细菌病毒生长繁殖

大肠杆菌也是最早用作基因工程的宿主菌

工业上生产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶和制备天冬氨酸、苏氨酸及缬氨酸等

大肠杆菌也是食品业和饮用水卫生检验的指示菌根霉(Rhizopus)

代表种米根霉R.oryzae)黑根霉(R.nigrican)等。

应用:①根霉能产生一些酶类,如淀粉酶、果胶酶、脂肪酶等,是生产这些酶类的菌种。在酿酒工业上常用做糖化菌。②有些根霉还能产生乳酸、延胡索酸等有机酸。③有的也可用于甾体转化

分布:广泛分布于土壤、空气中,也常见于水果、蔬菜、各类淀粉食物、谷物上,引起霉腐变质。

形态特征:菌丝发达、繁密;白色无隔多核,为单细胞真菌。

形态特征:毛霉的孢子囊梗有单生的,也有分枝的。分枝有单轴、假轴两种类型。

毛霉的菌丝多为白色,孢子囊黑色或褐色,孢子囊孢子大部分无色或浅兰色,因种而异。

繁殖:可形成孢囊孢子、厚垣孢子、接合孢子。

分类:多数属于子囊菌亚门,少数属于半知菌亚门。

分布:广泛分布于土壤、空气和谷物上,可引起食物、谷物和果蔬的霉腐变质,有的可产生致癌性的黄曲霉毒素。

形态特征: 菌丝发达多分枝,有隔多核,分生孢子梗由特化了的厚壁而膨大的菌丝细胞——foot cell足细胞)上垂直生出;分生孢子头状如菊花。曲霉的菌丝、孢子常呈现各种颜色,黑、棕、绿、黄、橙、褐等,菌种不同,颜色各异。

繁殖:无性繁殖产分生孢子;大多数有性阶段不明,归为半知菌类。少数种可形成子囊孢子,归为子囊菌亚门。---大多数为无性世代产分生孢子;少数种可形成子囊孢子。

代表种:黑曲霉(Asp . Niger、黄曲霉(Asp.flavus)

应用是制酱、酿酒、制醋的主要菌种。②是生产酶制剂(蛋白酶、淀粉酶、果胶酶)的菌种。③生产有机酸(如柠檬酸、葡萄糖酸等)④农业上用作生产糖化饲料的菌种。

分类:多数属于子囊菌亚门,少数属于半知菌亚门。

分布:广泛分布于土壤、空气、粮食和水果上,可引起病害或霉腐变质

形态特征:与曲霉类似,菌丝也是由有隔多核的多细胞构成。但青霉无足细胞,分生孢子梗从基内菌丝或气生菌丝上生出,有横隔,顶端生有扫帚状的分生孢子头。分生孢子多呈蓝绿色。扫帚枝有单轮、双轮和多轮,对称或不对称。

繁殖:无性繁殖产分生孢子;大多数有性阶段不明,归为半知菌类。少数种可形成子囊孢子,归为子囊菌亚门。

代表种:产黄青霉(Pen.chrysogenum)

桔青霉Pen.citrinum)

展青霉(Pen.patulum)

应用:是生产抗生素的重要菌种,如产黄青霉和点青霉都能生产青霉素。

生产有机酸,如葡萄糖酸、柠檬酸

危害:霉变、疾病 

 

 

 

 

 

 

 

 

第四章  微生物遗传

4.1. 基因结构和基因组

一、基因结构和基因概念的发展

1.基因结构

从分子遗传学的角度上讲,基因是一段具有特定功能和结构的连续的DNA片段,是编码蛋白质或RNA分子遗传信息的基本遗传单位。一个完整的基因,不仅包括编码区,还包括5末端和3末端长度不等的特异性序列,它们虽然不编码氨基酸,却在基因的转录过程中起着重要的调节作用(图129)。

1 原核基因的结构 

所有原核基因都有一个编码区,依基因类型的不同,或是编码一种蛋白质多肽或是编码一种RNA结构,如 tRNA rRNA。在原核基因编码区两侧,还存在着用于控制转录作用的调节区,即启动子和终止子。在DNA链上,由起始密码子开始到终止密码子为止的一个连续编码序列,叫做开放阅读框架(open reading frameORF),也就是所谓的编码区。

启动子(promoter)是位于基因5末端上游外侧紧挨转录起点的一段长度为20200bp的非编码的核苷酸序列,其功能是与RNA聚合酶结合形成转录起始复合物。原核生物的启动子大约4050bp,其中包含有转录的起始点和两个区(-35区和-10区)。起始点是DNA模板链上开始进行转录作用的位点,通常在其互补的编码链对应位点(碱基)标以+1-10区是RNA聚合酶核心酶与DNA分子紧密结合的部位,大多包含有6bp的共有序列,即:TAT AAT-35区是RNA聚合酶σ因子识别DNA分子的部位,其共有序列为:TTGACA

终止子(terminator)是位于一个基因或一个操纵子的末端,提供转录停止信号的DNA区段。与启动子不同的是终止子仍能被RNA聚合酶转录成mRNA。大肠杆菌的终止子分为两类:一类是不依赖于RhO蛋白质辅助因子(现在一般称做ρ因子)而能实现终止作用,这类终止子称为强终止子;另一类是依赖于ρ因子才能实现终止作用,这类终止子属于弱终止子。

在原核生物中只有一种RNA聚合酶。所有原核基因,包括编码蛋白质的基因和编码RNA的基因都是在同一种RNA聚合酶的作用下进行转录。

2 真核基因的结构 

与原核基因一样,一个完整的真核基因,不仅包括编码区,还包括编码区两侧的调节序列。真核生物的蛋白质编码基因以及某些tRNA基因的编码序列,都被一种叫做内含子(nitron)的非编码序列所间断。在基因的表达过程中,内含子便从初级mRNA分子中被剪接掉,形成成熟的功能mRNA

另一个特点是真核生物有三种不同的RNA聚合酶,各自负责转录不同类型的基因。这三种 RNA聚合酶分别叫做PolPolPol

Pol转录rRNA基因(5SrRNA除外),Pol转录蛋白质编码基因,Pol转录编码众多小RNA(包括 tRNA 5S rRNA)的基因。真核生物中这三种 RNA聚合酶所识别的启动子和调控序列在结构上存在一定的差异。

真核生物编码蛋白质的基因启动子,与原核生物的启动子相似,也具有两个高度保守的共有序列。另外,还有一部分DNA序列能增强或减弱真核基因转录起始的频率,这些区域称为增强子(enhance)和沉默子(silencer)。

增强子是指能使和它连锁的基因转录频率明显增强的DNA序列,长度一般为100200bp。增强子是1981年首先在SV40病毒的早期基因的上游发现的。目前,在病毒、真菌、植物、动物和人类正常细胞里都发现有增强子的存在。  

沉默子是在酵母交配型座位中首次发现的。目前,在动物、人类的细胞中都发现有沉默子。沉默子属于负调控元件,可不受距离和方向的限制,并可对异源基因的表达起作用。沉默子在真核生物细胞中对成簇基因的选择性表达起重要作用。 

真核基因的 3末端序列区具有终止转录作用的信号以及 mRNA 3末端转录后加工的信号。许多基因都是在特定的序列处终止转录,除了某些组蛋白的mRNA之外,大多数的mRNA分子的3末端都有一段polyA)尾巴,它的长度一般为200个核苷酸,不过酿酒酵母的大多数mRNA转录物则只有50个核苷酸左右的polyA)尾巴。 

2. 基因概念的不断发展和更新

随着重组DNA技术和DNA序列分析技术的发展,对基因的认识又有了新的发展和更新,主要是发现了重叠基因、断裂基因、移动基因(转座因子)、假基因等新现象。

 重叠基因(overlapping gene

重叠基因是指一个基因的核苷酸与另一个基因的核苷酸之间存在着一定程度的重叠现象。重叠基因有两种类型:第一种类型是一个基因的核苷酸序列完全包含在另一个基因的核苷酸序列之中;第二种类型是一个基因的末端密码子与另一个基因的起始密码子之间的少数核苷酸之间的重叠。基因重叠现象最初在测定X174噬菌体DNA的核着酸序列时发现,后来在许多细菌中也发现有基因重叠现象。

 断裂基因(spht gene

所谓断裂基因就是基因的编码序列在 DNA分子上是不连续的,为不编码的序列所隔开。编码的序列称为外显子(exon),不编码的序列称为内含子(nitron)。断裂基因在表达时,RNA聚合酶先将该基因的全部遗传信息(包括外显子和内含子)转录成为一条长的前体mRNA,又叫核内不均一RNAhnRNA),然后经过删除和连接,除去内含子,便形成了成熟的mRNA分子,最后才翻译成蛋白质。

高等真核生物的基因多数都有内含子,原核生物的基因一般没有内含子。断裂基因分布很广,真核生物的绝大多数结构基因都含有内含子,内含子是基因的组成部分,也是遗传物质。在不同的基因中,内含子的大小和数目变化很大,有的只有一个或少数几个,有的可多达十几个。一般认为,断裂基因的存在有利于生物的变异、进化,有利于储存较多的遗传信息。 

 假基因 pseudogene

假基因是与功能性基因密切相关的DNA序列,但由于缺失、插入和无义突变失去阅读框架而不能编码蛋白质产物。

⑷移动基因(movable  gene

移动基因又叫做转座因子(transposable  element)。由于它可以从染色体 DNA上的一个位置转移到另一个位置,因此在文献上有时也形象地称之为跳跃基因(jumPing gene) 

二、基因组学

基因组学是研究生物体基因和基因组的结构组成、不稳定性及功能的一门学科。随后又把基因组学分成结构基因组学(structural genomics)和功能基因组学(functional genomics)。前者指研究基因和基因组的结构,各种遗传元件的序列特征,基因组作图和基因定位等。后者则着重研究不同的序列结构具有的不同功能,基因表达的调控,基因和环境之间(包括基因与基因之间,基因与其他DNA序列之间,基因与蛋白质之间)相互作用等。

此外,目前对生物基因组的研究,又根据研究对象和具体目标而分别出现了人类基因组研究、病原体基因组研究、微生物基因组研究、植物基因组研究、家畜基因组研究、模式生物基因组研究、药物基因组研究、比较基因组研究等,名目繁多,举不胜举。

那么什么是基因组呢?

所谓基因组(genome)是指单倍体细胞中所含的全套遗传物质。就大多数细菌和噬菌体而言,它们的基因组是指单个染色体上所含的全部基因,而二倍体真核生物的基因组则是指单倍体(配子或配子体)细胞核内整套染色体所含的DNA分子及其所携带的全部基因。除此之外,还有细胞器基因组。如动植物细胞都有的线粒体基因组,以及植物细胞中的叶绿体基因组。

一般来说,微生物(无论是原核微生物还是真核微生物)基因组一般都比较小,其中最小的大肠杆菌噬菌体MS2只有3000bp,含3个基因。在对各种生物染色体分子的大小和基因组的研究中,总结出可以简单地用 10